0 引言 Introduction
周围神经缺损是临床创伤骨科常见病症，有较高的致残率。自体神经移植是一种效果较好的修复周围神经缺损的方式，但这种手术方式存在一些问题，会造成新的神经损伤，可提供移植的神经来源有限，还有增加新的创伤等。后来有些学者用异体神经、羊膜、动静脉等材料桥接修复周围神经缺损，但没有得到满意的实验效果。于是人造材料开始成为神经导管的研究方向，其中较热门的就是可降解的人造高分子材料。
随着组织工程学及基因工程学的高速发展，神经组织支架已成为组织工程化神经中最基础、最重要的组成部分[1]，即把周围神经损伤断端用神经支架导管桥接修复，从而提供损伤神经再生的通路；同时合适的神经营养因子和引导环境能满足神经再生的需要，促进神经的生长和修复。而随着神经营养因子的发现，近年来对周围神经缺损修复的研究已经由解剖学连续性向生物学修复治疗转变，各种生物修复材料不断发展[2-4]。其中，脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor，BDNF)是中枢及周围神经系统的重要营养因子[5-6]，它可以通过神经肽的表达来保持细胞内钙离子的平稳状态；能通过对抗自由基的损伤，增加细胞内抗氧化酶的活性及刺激细胞的修复；还可以通过调节细胞膜上钙通道蛋白的表达而影响钙离子流，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用，而且能促进受损伤神经元再生及分化等生物效应。但BDNF 作为一种活性蛋白的稳定性较差，在水溶液中易失活，而且易受酸碱酶的破坏。为解决上述问题，将其制成缓释微囊以达到长期释药的效果。“生物微囊”是通过将酶、蛋白质和激素等生物活性物质包封在选择性透过膜中，通过微囊膜的选择透过作用发挥良好的缓释、控释和靶向递药特性[7]。
实验采用乳化-溶剂挥发法与聚合物合金法制备BDNF缓释微球[8-9]，并将微球注入到几丁糖/聚乙烯醇导管内桥接修复周围神经缺损，观察其促进神经再生的作用。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 随机对照，动物实验观察。
1.2 时间及地点 于2018 年8 月至2019 年4 月在河北医科大学第二医院动物实验室完成。
1.3 材料 几丁糖/聚乙烯醇神经导管(上海其胜生物制剂有限公司)；BDNF(北京康肽生物科技有限公司)；聚乳酸/聚乳酸-羟基乙酸共聚物 (北京化学试剂公司)；几丁糖(上海其胜生物制剂有限公司)；聚乙烯醇PvA-124(北京化学试剂公司)；牛血清白蛋白(北京奥博星生物技术责任有限公司)；二氯甲烷(北京化学试剂公司)；双通道肌电图仪(Medtronic KeyPoint，丹麦)。
实验动物：选用健康成年雄性SD 大鼠60 只，体质量250-300 g，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2018-004。动物实验获得河北医科大学第二医院科研伦理委员会批准。
1.4 实验方法
1.4.1 几丁糖/聚乙烯醇导管的制备[10]配制 2%的几丁糖溶液，利用 1%NaOH 溶液调整pH 值至9.0-10.0 之间，先搅拌均匀，后静置脱泡，再加入少量 2%双缩水甘油醚，再次搅拌均匀后置入50 ℃恒温水域中反应 20-24 h；然后加入聚乙烯醇，使其与壳聚糖的质量比为 2 ∶3，混合均匀、脱泡后，加入到神经导管模具中，置入-20 ℃冰箱中深冻，再取出，室温下融化后再深冻，如此步骤反复四五次；最后一次融化后将凝胶柱取出，利用旋转干模设备于室温下旋转风干，再用蒸馏水中浸泡 30 min，自动脱模，然后分别在不同的时间更换新鲜蒸馏水，从而去除残留的交联剂和碱性物质，再风干，修剪，60Co 照射灭菌，最后形成内径 1.5 mm、壁厚 0.3 mm、长度 2.0 cm 的神经导管，使用前用生理盐水浸泡2 h。
1.4.2 制备BDNF 缓释微球[8]采用乳化-溶剂挥发法(S/O/W)与聚合物合金法制备BDNF 缓释微球[9]，分为2 步：
(1)BDNF 微粉化：牛血清白蛋白溶液0.5 mL(含牛血清白蛋白10 mg)与纯化的BDNF 300 μg 混合后行冻干处理，设定温度-50 ℃，降温速度20 ℃/min，设定冻干条件(-20 ℃3 h；20 ℃12 h)。将混合物冻干后获得均匀分布于牛血清白蛋白基质中的BDNF 药粉(S)。
(2)BDNF 微囊化：聚乳酸/聚乳酸-羟基乙酸共聚物(聚乳酸∶聚乳酸-羟基乙酸共聚物=1 ∶3)300 mg 放入试管内，加入所制BDNF 冻干粉和2 mL 的二氯甲烷使聚合物溶解成为油相(O)。2%聚乙烯醇溶液10 mL(W) 是水相。将2%聚乙烯醇溶液10 mL(W)加入油相(O)中，再高速匀浆30 s，就形成S/O/W 乳液， 然后在400 mL 10%的去离子水氯化钠溶液中倒入复乳，再在室温下磁力搅拌，1 700 r/min 搅拌2 h，前半小时冰浴，再800 r/min 搅拌2 h 挥发残余有机溶剂，收集微球，去离子水洗涤3 遍，真空冻干，得微球260 mg，置于4 ℃保存。
1.4.3 实验动物造模及分组 大鼠称质量后，采用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔内注射麻醉大鼠。将动物俯卧位固定，脱毛消毒后做右后肢后部切口，显露右侧坐骨神经，在距梨状肌出口远侧端 0.5 cm 处切断并切除 15 mm 坐骨神经，分4组处理：A 组坐骨神经切除15 mm，倒转后直接缝合；B 组几丁糖/聚乙烯醇导管套接后注满生理盐水；C 组几丁糖/聚乙烯醇导管套接后注满BDNF 溶液；D 组几丁糖/聚乙烯醇导管套接后注满BDNF 缓释微球。B、C、D 组4 倍显微镜下将2 个神经断端分别植入17 mm 几丁糖/聚乙烯醇导管，两神经断端均植入导管1 mm，神经实际缺损仍为15 mm，将神经外膜与管壁缝合固定。术后4 个月观察大鼠神经再生各项指标。
1.5 主要观察指标
大体观察：术后定期观察足部运动变化及伤口愈合的情况，观察右后肢关节僵直、屈伸及肌肉萎缩情况。取标本时观察神经导管颜色、导管降解、与周围组织有无粘连及表面血管形成等情况。
电生理学检测：在取组织标本前做电生理检查。麻醉同上法，沿原切口显露分离坐骨神经，用双通道肌电图仪测定并记录复合神经肌肉动作电位及运动神经传导速度。参数选择：刺激强度6.0-7.0 mA，灵敏度5 mV/D，方波波宽0.2 ms，频率1 Hz，扫描速度3 ms/D。
组织学观察：取再生段坐骨神经中段5 mm，先行横向切片，再行纵向切片，然后行苏木精-伊红染色和SP 染色进行组织学观察，观察神经再生和髓鞘形成情况等。取5 处为单位视野，分别是神经横断面右上、左上、右下、左下和正中部，计数有髓神经纤维数，并用平均值作为单位视野有髓神经纤维密度，同时测定有髓神经纤维髓鞘厚度和直径。
1.6 统计学分析 统计分析应用SPSS 17.0 统计软件包。数据以±s表示，应用单因素方差分析进行组间比较，应用t检验进行两两比较，检验水准α=0.05。
2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析 60 只大鼠均纳入结果分析。
2.2 大体观察结果 各组术后切口瘢痕外观无差别。所有大鼠术后即出现右后肢行走困难，随即有皮肤光滑、变薄等神经营养障碍表现的发生，自术后2 周起，右足趾均出现红肿表现，随时间延长逐渐恢复，未发生溃疡及脱趾现象。术侧小腿肌肉三头肌有不同程度萎缩，其中A 组及D 组肌肉萎缩较另外2 组轻。各组大鼠右后肢均有不同程度的关节僵直，且随时间延长而加重。术后4 个月取材时，大体观察见各组移植物均与周边组织有粘连，其中与周围组织粘连较重的是自体移植段神经。B、C、D 组神经导管失去弹性，硬度下降，但还未完全降解吸收。D 组再生神经已填满导管，将近、远神经两端连接。
2.3 电生理检测结果 A 组和D 组坐骨神经传导速度最快，两组间比较差异无显著性意义(P＞ 0.05)；A、D 组坐骨神经潜伏期、传导速度、诱发电位均明显优于B、C 组(P＜ 0.01)；C 组坐骨神经潜伏期、传导速度、诱发电位均优于B 组(P＜0.05)，见表1。
表1 ｜术后4 个月时各组大鼠肌电图检查结果 (±s，n=15)Table 1 ｜Rat electromyography results in each group 4 months after surgery表注：A 组植入自体坐骨神经，B 组植入几丁糖/聚乙烯醇神经导管后注射生理盐水，C 组植入几丁糖/聚乙烯醇神经导管后注射脑源性神经营养因子溶液，D 组植入几丁糖/聚乙烯醇神经导管后注射脑源性神经营养因子缓释微球。与A 组比较，aP＜ 0.01；与B 组比较，bP＜ 0.05，cP＜ 0.01；与C 组比较，dP＜ 0.01组别 潜伏期(ms) 诱发电位(mV) 传导速度(m/s)A 组 3. 13. 34. B 组 5. 9. 26. C 组 4. 10. 29. D 组 3. 12. 33.
2.4 组织学观察结果 术后4 个月显微镜下观察见B、C、D 组神经导管内均有再生的神经纤维，周围有神经外膜的包裹，其中神经纤维数目较多的是D 组，神经纤维大小均匀，SP 染色见其明显髓鞘化；B、C 组神经排列较乱，苏木精-伊红染色见结缔组织较多；A 组再生神经纤维排列紧密，再生神经排列整齐，且纤维直径较大，见图1。各组SP 染色见图2。
统计学分析显示，A 组与D 组神经纤维直径、髓鞘厚度、神经纤维计数比较差异均无显著性意义(P＞ 0.05)；A、D 组神经纤维直径、髓鞘厚度、神经纤维计数多于B、C组(P＜ 0.01)，见表2。
图 1 ｜术后4 个月各组再生神经纵断面形态观察(苏木精-伊红染色，×400)Figure 1 ｜Morphological observation of regenerated nerve in each group at 4 months after operation (hematoxylin-eosin staining, ×400)图注：a 为A 组(植入自体坐骨神经)，再生神经纤维排列致密规则；b 为D 组(植入几丁糖/聚乙烯醇神经导管后注射脑源性神经营养因子缓释微球)，再生神经纤维排列较致密，欠规则；c 为C 组(植入几丁糖/聚乙烯醇神经导管后注射脑源性神经营养因子溶液)，再生神经纤维排列较稀疏紊乱；d 为B 组(植入几丁糖/聚乙烯醇神经导管后注射生理盐水)，再生神经纤维排列较稀疏紊乱
图2 ｜ 术后4 个月各组再生神经形态观察(SP 染色，×400)Figure 2 ｜Morphological observation of regenerated nerve in each group 4 months after operation (SP staining, ×400)图注：A 组(植入自体坐骨神经)，神经纤维个数和直径较大，髓鞘较厚，排列较规则；D 组(植入几丁糖/聚乙烯醇神经导管后注射脑源性神经营养因子缓释微球)，神经纤维个数和直径较大，髓鞘较厚，排列较规则；C 组(植入几丁糖/聚乙烯醇神经导管后注射脑源性神经营养因子溶液)，神经纤维直径及个数较小，髓鞘厚度较小，排列较乱；B 组(植入几丁糖/聚乙烯醇神经导管后注射生理盐水)，神经纤维直径及个数较小，髓鞘厚度较小，排列较乱
表2 ｜术后4 个月各组大鼠再生神经组织学检测结果 (±s，n=15)Table 2 ｜Histological inspection of the regenerated nerve in each group 4 months after surgery表注：A 组植入自体坐骨神经，B 组植入几丁糖/聚乙烯醇神经导管后注射生理盐水，C 组植入几丁糖/聚乙烯醇神经导管后注射脑源性神经营养因子溶液，D组植入几丁糖/聚乙烯醇神经导管后注射脑源性神经营养因子缓释微球。与B、C 组比较，aP＜ 0.01组别 神经纤维直径(μm) 髓鞘厚度(μm) 神经纤维计数(个/400 视野)A 组 4. 0. 259. B 组 3. 0. 158. C 组 3. 0. 188. D 组 4. 0. 251.
3 讨论 Discussion
周围神经广泛分布于躯干和四肢，协调和控制躯体功能，因在外伤中容易受损而引起肢体严重的功能障碍，且治疗效果不佳，患肢致残率高，是创伤骨科的一大难题。目前随着基因和组织工程学的高速发展，已研究出很多修复周围神经缺损及促进周围神经再生的新方法，例如采用聚乳酸导管桥接，自体动、静脉移植，神经再生室修复神经缺损等[7]。其中，通过神经导管桥接修复周围神经缺损因为可以为神经再生提供适合的微环境而越来越受到学者的重视[11]，它能提供神经再生的唯一通道，阻止周围结缔组织的侵入和瘢痕的形成；另外，它能保持外源性和内源性促进神经再生的营养因子、生长因子等物质。
甲壳素及其代谢物对人体无毒、无免疫原性、无刺激，同时具备良好的生物组织相容性及可降解性，其作为神经替代材料修复周围神经缺损已得到广泛研究[12]。以往的研究发现，几丁糖导管可促进周围神经缺损的修复[13]。因几丁糖导管的机械强度较差、容易塌陷等原因，有研究者将几丁糖与聚乙烯醇融合，发明几丁糖/聚乙烯醇导管。聚乙烯醇是一个具备良好生物相容性和降解性的合成材料，在生物医药领域已经得到广泛应用。几丁糖与聚乙烯醇的镶嵌结合增加了导管的机械强度和维持时间，为神经再生提供了良好的导管材料[14-15]。此次实验也证实了几丁糖/聚乙烯醇导管用于桥接大鼠坐骨神经后，其周围未见红肿、化脓等炎性表现，术后4 个月后导管组大鼠均有明显的神经再生，导管外形存在，表面覆盖了一层菲薄的纤维组织膜，无完全塌陷或降解的情况。
神经营养因子的应用实现了对周围神经缺损从解剖学连续性修复向生物学修复治疗的转变，神经营养因子可通过上调神经元细胞黏附分子的表达而改变神经再生微环境，从而促发轴突的再生[16-18]。生物分子类药物微囊化技术可使药物在体内控释、缓释，从而延长其作用时间，提高疗效[19-21]。BDNF 是在脑内合成的一种蛋白质，对神经细胞的分化、存活及生长发育均有重要作用，还能改善神经细胞的病理状态，加速受损伤神经细胞再生、分化，防止神经细胞受损伤死亡等生物效应[22]，而且也是成熟的中枢及周围神经系统维持生存及正常生理功能所必须的物质[5]。此次实验证实，导管内注入BDNF 缓释微球能增强缺损神经再生，有利于缺损神经的恢复，且效果接近自体神经移植。
综上所述，实验通过在几丁糖/聚乙烯醇导管内注入BDNF 缓释微球桥接大鼠坐骨神经缺损，结果发现BDNF 缓释微球能有效促进神经再生和成熟，明显优于导管内一次性给予神经生长因子和单纯导管桥接，为周围神经缺损修复提供了新的治疗方法。
作者贡献：史正亮、张华进行实验设计，实验实施为史正亮、张华、范志勇、袁鹤，实验评估为马维，资料收集为杨冰，史正亮成文，张华审校。
经费支持：该文章未接受任何经费支持。
利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
机构伦理问题：动物实验获得河北医科大学第二医院科研伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。
文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。
文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。
生物统计学声明：该文统计学方法已经河北医科大学生物统计学专家审核。
文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。
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文章来源：神经药理学报 网址: http://sjylxb.400nongye.com/lunwen/itemid-42008.shtml
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